单细胞蛋白质组学 | SCoPE-MS
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文章信息
文献标题：SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation
发表时间：2018.10.22
发表杂志：Genome Biology（IF=10.806）
原文链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-018-1547-5
摘要
在一些重要的生物学问题中，需要对单细胞中的蛋白组数据进行定量分析。这篇文章中，作者提出了根据单细胞蛋白质组数据对人类肿瘤细胞类型进行识别的方法——SCoPE-MS ，并在小鼠正在分化的胚胎干细胞中定量了超过一千种蛋白质。单细胞蛋白质组学提出了利用蛋白质组数据对细胞类型定义的新方法，并能推断细胞类型与特定的蛋白质丰度之间的潜在关系。单细胞蛋白质组与转录组之间的对比分析表明，mRNA和蛋白质水平之间存在共变关系，而许多基因能在mRNA和蛋白质水平发挥协同调控作用。
背景介绍
建立在细胞层面的差异分析，是理解人体正常生理活动，解决肿瘤免疫、干细胞疗法等问题的关键，这需要对单细胞蛋白质组进行量化分析。然而，过去对哺乳动物单细胞蛋白质的定量方法停留在免疫成像和测定抗体蛋白这两种研究方法。免疫荧光成像技术有效，但只限于对细胞中的一些蛋白质进行定量，并会在图像中产生伪影。建立在抗体蛋白上的检测方法在近几年有了很大的突破和发展，但仍然存在一些技术方面的缺陷。
另一方面，作者提到了应用液相色谱法 (liquid chromatography) 和串联质谱法(tandem mass spectrometry)能在bulk样本中对几千种蛋白质进行定量，并推断这种方法沿用在单细胞中对蛋白质进行定量的合理性。作者发现每个细胞中主要蛋白质的拷贝数超过50000，而现在的质谱分析仪器能够对分子的上百个拷贝数进行定量。因此，只要能够从单细胞中得到1%的蛋白质拷贝进行质谱分析，便能进行精准的定量。
SCoPE-MS的技术方法
首先，作者提出SCoPE-MS需要解决两个重要的技术问题：
1）在对单细胞中的蛋白质转移到用于质谱分析的载体过程中，如何最小化提取过程中蛋白质的损失？
2）如何实现同时对单细胞样本中的肽分子进行识别和定量？
对于第一个问题，作者利用人工方法在显微镜下分离存活的单细胞，并通过声波的方法将细胞进行裂解(图a)。过去使用化学方法对细胞进行裂解，需要对使用的化学药剂进行清除，而这种方法会间接造成单细胞中蛋白质的损失。然后，从细胞的裂解产物中提取的蛋白质在90度时快速变性，并在45度中利用胰酶进行消化。同时，SCoPE-MS通过构建载体细胞的形式运输蛋白。载体细胞能够有效减少由于蛋白质表面的黏附作用造成的蛋白质流失。
对于第二个问题，作者采取的方法是串联质谱标签(TMT)进行定量蛋白分析。这项技术可以对一次实验中多个样本进行全蛋白组定量分析。在单细胞层面，TMT能够通过标记每个样本中的肽段后对肽段进行识别和定量。
对于TMT标记肽段的定量依赖于报告离子(reporter ion, RI)，RI的表达水平能够反映肽段的丰度和噪声的分布。作者通过计算信噪比，得出RI的强度在非空闲的信道中与标记的肽段数量成比例，而在空闲的信道中强度普遍较低的结论。
为了检验和评估SCoPE-MS的功能，作者通过将SCoPE-MS定量单细胞蛋白质的方法和bulk样本定量蛋白的方法进行对照分析(图b-e)。结果表明，SCoPE-MS尽管含有更多噪声，但定量结果的精确度和重现度更高。
应用SCoPE-MS研究分化中的胚胎干细胞
作者通过SCoPE-MS这种方法，对小鼠的胚胎干细胞在分化过程中的单细胞层面的蛋白质表达的异质性和动态变化进行了量化分析(图a-d)。作者从胚胎干细胞的培养液去除白细胞抑制因子(LIF), 并进行悬浮培养。图a反映的是在去除LIF后3、5、7天的细胞中根据蛋白质表达计算协方差相关系数并进行层次聚类的结果，揭示了胚胎干细胞各分化阶段的每个group之间的蛋白质表达关联度的差异。图a中三张图的每一行或者每一列为一种蛋白质关于所有蛋白质的关联向量。然后，作者分别对day3、day5、day8两两进行关联向量的关联度分析，图b反映了day5和day8之间的关联向量的平均关联度最高，说明day5和day8之间的蛋白质的关联向量的情况更加相似。
图c是对细胞中的核糖体蛋白的表达进行关联度分析的结果。从heatmap的结果能够反映核糖体蛋白表达之间的关联度要显著高于其他蛋白表达之间的关联度(利用图c和图a中的三张图进行比较可以得出结论)。图d是根据GO，分别对每一种特定功能对应的蛋白质group中的蛋白质进行表达量的关联度分析。
作者对不同分化阶段的胚胎干细胞的蛋白质进行关联度分析之后，进行了主成分分析。作者的分析过程也就是将SCoPE-MS与一系列常规的组学的统计方法结合。作者首先对比了在bulk样本中识别的不同蛋白质丰度的数量分布和单细胞样本中对应的蛋白质的分布情况(图a)。由此可见，在单细胞中蛋白质丰度总体要高于bulk样本。
图b是作者利用主成分分析day3、day5、day8的共计190个细胞的蛋白质表达差异。主成分分析的主要目的在于对蛋白质的表达进行降维，选取三个主要成分能够对190个细胞的蛋白表达情况进行区分和可视化。图c是作者所选取的3个主成分所对应的方差解释度和其他的相关信息。图d-e展现的是作者对day8的细胞分别选取不同的两个维度对两类功能的相关蛋白质group的表达水平进行可视化。
单细胞蛋白质组和单细胞转录组的对比分析
最后，作者沿用了多组学的一贯套路，将单细胞蛋白质组学的数据和单细胞转录组的数据进行对比分析。
图a是作者利用Klein在2015提供的胚胎干细胞不同分化阶段的scRNAseq数据，对mRNA的表达进行关联度分析。图b是作者提供的单细胞蛋白质组的关联度分析结果。作者通过结合单细胞转录组和单细胞蛋白质组的数据，可以观察基因是否能够在mRNA和蛋白质水平共同表达。图c是作者利用图a和图b中的层次聚类结果，比较单细胞转录组和单细胞蛋白质组数据的overlap情况。图d是蛋白质关联度和它们相对应的mRNA的关联度之间进行关联度分析的结果。图e反映了不同功能对应的基因在mRNA和蛋白质水平表达协同性的情况，说明核糖体相关的蛋白质(RPS和RPL)表达具有的协同性更高。
总结
选择这篇文章的原因是近期我对单细胞多组学的有关研究的关注。过去有几年的时间内，我们关注的重心都是只停留在单细胞转录组层面，但是蛋白质是作为生物体行使主要功能的基本单位，对我们认识生命的基本活动和病理变化均有重要意义。但是单细胞蛋白质组学距离发展成熟还有相当遥远的一段距离。前段时间我看到《Nature Methods》上的一篇文章《Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics》，于是我产生了回溯近两三年单细胞蛋白质组学发展的兴趣，我也会在后面更新一系列和单细胞蛋白质组学有关的文章。
这篇文章和很多单细胞领域的文章一样，从介绍技术，并结合技术的应用进行分析。但是由于这篇文章是单细胞蛋白质组学的一个开端，因此存在着一系列缺陷，包括在文章的后半段也仅仅停留在一些比较简单的统计方法和常规的思路上。尽管如此，这篇文章在开篇提出的技术方法，即结合液相色谱法和串联质谱法对单细胞层面的蛋白质进行定量的方法具有开创性的意义。这项技术方法在第二代产品(SCoPE2)中有了很大的改进，无论是样本的制备，还是质谱分析方法都有了很大的改进。
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